一文帶你讀懂單細(xì)胞基因測序市場分析

什么叫做單細(xì)胞基因測序（Single-Cell Sequencing）？

一句話說，就是單個(gè)細(xì)胞水平上對基因組進(jìn)行測序。2013年，自然雜志把年度技術(shù)授予了單細(xì)胞基因測序（Single CellSequencing），認(rèn)為該技術(shù)將改變生物界和醫(yī)學(xué)界的許多領(lǐng)域。

我們?yōu)槭裁匆�進(jìn)行單細(xì)胞基因測序？

傳統(tǒng)的測序方法，無論是基因芯片或者二代基因測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）都需要從超過10萬個(gè)細(xì)胞中提取一大堆（bulk）DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆細(xì)胞的平均值。但是傳統(tǒng)的方法，對于理解人體細(xì)胞的多樣性有著明顯的局限性。

在人體的每一個(gè)組織中，比如說，腎臟組織，擁有著大量不同的細(xì)胞類型，每一種細(xì)胞類型有著獨(dú)特的起源和功能。每一個(gè)細(xì)胞的譜系和發(fā)展的狀態(tài)又決定了每個(gè)細(xì)胞如何和周圍的細(xì)胞和環(huán)境如何反應(yīng)，把基因測序應(yīng)用到單個(gè)細(xì)胞層面，對于我們理解細(xì)胞的起源，功能，變異等有著至關(guān)重要的作用。

在本篇報(bào)告中，我們將詳細(xì)解讀單細(xì)胞基因測序，以及該技術(shù)對癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)等領(lǐng)域帶來的新的突破。

一、單細(xì)胞基因測序行業(yè)：剛啟程，面臨引爆點(diǎn)

BCC Research的一項(xiàng)分析報(bào)告指出，2014年全球單細(xì)胞分析（Single-cell Analysis）的市場達(dá)5.4億美金，預(yù)測將從2015年的6.3億美金增長到2020年的16億美金，復(fù)合增長率達(dá)21%。根據(jù)GENReports的報(bào)告，關(guān)于單細(xì)胞分析的文章發(fā)表在過去的幾年也有著爆發(fā)性的增長。

 

單細(xì)胞分析的文章發(fā)表數(shù)量

其中，傳統(tǒng)的單細(xì)胞基因組學(xué)主要是由基因芯片和PCR主導(dǎo)的，隨著二代基因測序的成本以超摩爾定律下降，目前單細(xì)胞基因組學(xué)逐漸由二代基因測序技術(shù)接棒。

和qPCR在90年代的發(fā)展一樣，目前所有的刺激因素（高度的科研興趣，生物醫(yī)藥巨頭公司的關(guān)注等）正在解鎖這個(gè)市場，單細(xì)胞基因測序行業(yè)正面臨引爆點(diǎn)。

二、單細(xì)胞基因測序的基本流程：單細(xì)胞分離--基因組擴(kuò)增--測序和分析

單細(xì)胞測序，簡單地說，主要經(jīng)過如下的步驟：單細(xì)胞的分離--DNA/RNA的提取和擴(kuò)增（全基因組擴(kuò)增和全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增）---測序以及后續(xù)的分析和應(yīng)用。

 

單細(xì)胞測序的步驟

2.1 單細(xì)胞的捕捉和分離

單細(xì)胞測序的第一步是單細(xì)胞的分離和提取，目前的方法主要有如下幾種方法：流式細(xì)胞術(shù)，激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控技術(shù)。

單細(xì)胞分離的三種方式：流式細(xì)胞術(shù)，激光捕獲顯微切割以及微流控技術(shù)

1）流式細(xì)胞術(shù) （Flow Cytometry）

是指通過對于懸浮于流體中的細(xì)胞或者其他顆粒進(jìn)行定量分析和分選的技術(shù)。在各種流式細(xì)胞儀中，大家主要討論的是熒光活化細(xì)胞分類計(jì)FACS（Fluorescence Activated Cell Sorting）系統(tǒng)分離單細(xì)胞。定量原理：待測細(xì)胞經(jīng)特異性熒光染料染色后，加入樣品管中，經(jīng)過測量區(qū)，由染色后的細(xì)胞在激光照射下的熒光產(chǎn)生的電信號來進(jìn)行定量分析；分選原理：通過流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴來實(shí)現(xiàn)的。

2）激光捕獲顯微切割技術(shù)Laser Capture Microdissection（LCM）

LCM技術(shù)可以在顯微鏡直視下快速、準(zhǔn)確獲取所需的單一細(xì)胞亞群，甚至單個(gè)細(xì)胞，從而成功解決了組織中細(xì)胞異質(zhì)性問題。其基本原理是通過一低能紅外激光脈沖激活熱塑模-乙烯乙酸乙烯酯（EVA）膜，在直視下選擇性地將目標(biāo)細(xì)胞或組織碎片粘到該膜上。

3）微流控技術(shù)（Microfluidics）

微流控技術(shù)是一種用于精確控制微量液體的技術(shù)。微流控芯片是實(shí)施該技術(shù)的平臺，通常通過細(xì)微的管道對液體實(shí)施操控，微流控對液體的操控尺度，剛好適合于單細(xì)胞樣品的處理操作。

2.2 全基因組擴(kuò)增 （Whole Genome Amplification. WGA）/ 全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（Whole Transcriptome Amplification，WTA）：單細(xì)胞測序的難點(diǎn)

2.2.1 主要的三種全基因組擴(kuò)增技術(shù)，各有優(yōu)勢

由于在單細(xì)胞中的DNA和RNA的數(shù)量非常�。◣讉�(gè)pg），用傳統(tǒng)的測序儀無法檢測，所以科學(xué)家們必須首先對這些分子進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)盡量的減少錯(cuò)誤。目前的全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要有三種：簡并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增（DOP-PCR），多重置換擴(kuò)增（MDA）；和基于多次退火和成環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)（MALBAC）。

 

表1：三種類型的全基因組擴(kuò)增方式比較

Navin 在研究報(bào)告中指出（來源：Cancer genomics： one cell at a time），對于檢測CNV（Copy Number Variation）的時(shí)候，DOP-PCR以及MALBAC較有優(yōu)勢，另一方面， MDA方法一般用來檢測點(diǎn)突變。Gawad et al.，（2015）更是指出，三種全基因組擴(kuò)增技術(shù)并沒有明顯的勝者，具體方法的使用取決于研究的目的。

2.2.2 全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增

一個(gè)哺乳動(dòng)物的單細(xì)胞大約含有10pg的RNA，其中mRNA大約在0.1-0.5pg，并不能滿足目前測序平臺的要求，所以需要進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)。

單細(xì)胞中提取的RNA首先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，然后對逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。目前主要的轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)主要包括如下幾種：傳統(tǒng)的PCR，改進(jìn)的PCR，T7-in vitro 體外轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增以及Phi29聚合酶擴(kuò)增。

三、單細(xì)胞測序的主要應(yīng)用：癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)領(lǐng)域

當(dāng)單細(xì)胞被分離，細(xì)胞內(nèi)的DNA/RNA被提取和擴(kuò)增后，二代基因測序（Next GenerationSequencing）可以用來進(jìn)行后續(xù)的測序。當(dāng)把基因測序應(yīng)用于單個(gè)細(xì)胞層面，在下游應(yīng)用領(lǐng)域有著先天獨(dú)到的優(yōu)勢。

3.1單細(xì)胞基因測序技術(shù)有助研究癌癥起因和治療

首先談一下癌癥的異質(zhì)性：中晚期的腫瘤或由一系列的腫瘤克隆組成，每一種克隆有著獨(dú)立的變異，形態(tài)和藥物反應(yīng)。對于腫瘤克隆精準(zhǔn)的診斷非常重要，因?yàn)橐粋�(gè)占據(jù)原發(fā)性腫瘤5.1%的亞克隆種群在復(fù)發(fā)的時(shí)候可能成為主要的致病因素。

 

腫瘤的異質(zhì)性

實(shí)體瘤由一系列不同的細(xì)胞組成，包括癌癥纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等。同時(shí)，實(shí)體瘤由多個(gè)腫瘤克隆亞種群構(gòu)成，使得臨床樣本的分析更加復(fù)雜。當(dāng)多個(gè)腫瘤克隆同時(shí)存在時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)方法檢測的要么是平均信號要么是主要的克隆群體（并不一定是最致病的）的信號。

而同時(shí)，腫瘤的異質(zhì)性和癌癥產(chǎn)生抗藥性以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以，單細(xì)胞測序開始用來檢測腫瘤內(nèi)基因異質(zhì)性，對于癌癥起因以及后續(xù)治療的研究非常關(guān)鍵和重要。

例如，Navin et al.（2011）， 利用單細(xì)胞基因測序的方法（流式細(xì)胞術(shù)提取細(xì)胞-全基因組擴(kuò)增-NGS），在某個(gè)乳腺癌腫瘤組織中檢測了100個(gè)乳腺癌細(xì)胞的CNVs，覆蓋度大約6%，發(fā)現(xiàn)了三種完全不一樣的克隆亞種群。

除了腫瘤細(xì)胞，單細(xì)胞基因測序同樣可以應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells）和外周血播散腫瘤細(xì)胞DTC（disseminated tumor cells），該部分內(nèi)容將在后續(xù)的研究報(bào)告中深入討論。

3.2 單細(xì)胞基因測序助力輔助生殖

PGS（Pre-implantationGenetic Screening）是胚胎注入前遺傳學(xué)篩查，主要是通過檢測胚胎的23對染色體結(jié)構(gòu)、數(shù)目，來分析胚胎是否有遺傳物質(zhì)異常；PGD，主要用于檢測胚胎是否攜帶遺傳缺陷的基因。

PGD過程中，目前主要有三種方式獲得活檢材料：1）卵子的第一極體和第二極體；2）培養(yǎng)至第3天胚胎卵裂期的卵裂球細(xì)胞（一般取1-2個(gè)細(xì)胞）；3）培養(yǎng)第5天左右的囊胚細(xì)胞。

例如，牛津大學(xué)的Dr.Dagan Wells團(tuán)隊(duì)，通過對囊胚細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞基因測序，選擇健康的胚胎植入。另外，謝曉亮教授團(tuán)隊(duì)通過對女方卵細(xì)胞極體細(xì)胞進(jìn)行測序，結(jié)合胚胎選擇，選擇正常的胚胎移植。

卵母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生極體的過程（注：其中PB1和PB2是第一極體和第二極體）

3.3 單細(xì)胞基因測序打開免疫報(bào)多樣性研究之門

用單細(xì)胞基因測序分析免疫細(xì)胞的原因是現(xiàn)存的多樣的病原體導(dǎo)致了免疫細(xì)胞的高度異質(zhì)性，傳統(tǒng)的檢測方法，取樣來自一大堆細(xì)胞，低估了單個(gè)免疫細(xì)胞的多樣性，所以我們需要更加精確檢測單個(gè)免疫細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，從而理解機(jī)體復(fù)雜的免疫機(jī)制。正如開篇提到的Juno收購的單細(xì)胞基因測序公司AbVitro致力于T細(xì)胞和B細(xì)胞的基因測序。

下圖展示了對單個(gè)T細(xì)胞受體基因測序（TCR Sequencing）的流程。TCR α和βmRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增，重疊延伸，目的基因被選擇性地進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及后續(xù)的分析。

TCR Sequencing過程

四、單細(xì)胞基因測序未來的發(fā)展之路

在目前來看，單細(xì)胞基因測序還處在非常初級的階段，也面臨很多技術(shù)的挑戰(zhàn)，包括：如何高效的分離細(xì)胞，全基因組無偏差的擴(kuò)增，以及下游的數(shù)據(jù)分析等。但各大生物醫(yī)藥巨頭都已經(jīng)目光鎖定了這個(gè)方向，除了今年初Juno收購AbVitro（單個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行基因測序），去年八月BD公司收購了單細(xì)胞測序公司Cellular Research。Illumina也通過和Clontech合作，推出了單細(xì)胞RNA測序服務(wù)。

我們認(rèn)為，未來的基因測序一定朝著更精準(zhǔn)，更微觀的方向前進(jìn)，如今，單細(xì)胞測序正面臨著一場革命，在單個(gè)細(xì)胞層面讓我們在前所未有的水平理解基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多樣性。

（轉(zhuǎn)載來源：微流控）