不同細胞，其培養(yǎng)環(huán)境不同，我們需要不斷地調(diào)整培養(yǎng)模式，從而達到上佳的細胞狀態(tài)。

ES 細胞培養(yǎng)

原代胚胎成纖維細胞（ME）的制備

1.取12.5-13.5dpc孕鼠，斷頸處死；

2.將鼠腹面向上放置，70% 酒精潤濕、消毒腹部（防止腹毛飛揚，污染內(nèi)臟及子宮），剪開皮膚層、肌肉層，打開腹腔，將連接在子宮上的結(jié)締組織及脂肪剪去，將子宮取出，轉(zhuǎn)入無菌10cm平皿中；

3.把平皿轉(zhuǎn)入超凈臺；

4.用鑷子打開子宮壁，擠出鼠胚，并與胚外組織、胎盤等分離，除去鼠胚的頭、四肢及各種內(nèi)臟（主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等）；

5.將鼠胚移入另一新的無菌皿，用PBS洗三次；

6.棄去PBS，用彎頭剪將鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本無色（1－4次）；

7.加入適量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），體積約等于組織塊體積；

8.用滴管輕輕吹勻，室溫下消化1－10分鐘（或消化至溶液渾濁變粘），加入與消化液等體積培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻（5－10次），靜置；

9.沉降后將上部溶液輕輕吸出，轉(zhuǎn)入離心管中。

10.將細胞懸液管離心（1000轉(zhuǎn)5分鐘）；

11.棄去上清，向沉淀中加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸，將其分種至10 cm細胞培養(yǎng)皿，補加適量培養(yǎng)基，作標簽（ME－0；注意：若凍存，則可以使用復蘇后的0代ME制作Feeder；若直接使用則最好不用0代ME細胞做Feeder，要傳到一代以后再用來制作Feeder比較好），轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

12.視細胞生長情況換液（一般3天換液一次），若細胞已長滿，則凍存，或者1：3-5傳代（視細胞疏密而定），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（此后不用再換液）；1－5代的ME細胞均可用來制作Feeder。

飼養(yǎng)層細胞（Feeder）的制備

注：含10 ug/ml絲裂霉素C的DMEM血清培養(yǎng)基（FBS占10%）（實驗室所用MMC為10 mg/mL，Calbiochem）

1.棄去細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入適量含10ug/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS）；

2.放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3小時（2－4小時）；

3.用0.1% 明膠處理培養(yǎng)皿（將明膠加入，搖動使明膠覆蓋全部皿底，然后吸出明膠棄去即可），室溫放置2小時以上，至皿底明膠干燥為止；

4.棄去含有絲裂霉素C的培養(yǎng)基，加入2－3 mL PBS，輕輕搖動，棄去PBS，如此洗3-5次（必須洗3次以上，以便徹底洗去殘存的絲裂霉素，絲裂霉素是有絲分裂抑制劑，因而對ES細胞有毒性）；

5.加入適量胰酶消化30秒，吸去消化液，靜置至細胞層出現(xiàn)裂縫或明顯滑壁為止，加入培養(yǎng)基，吹打，種至明膠處理過的培養(yǎng)皿中即可（如細胞過稀，可再補加絲裂霉素處理過的細胞），半小時后即可使用（如果急用，則可以用ES細胞培養(yǎng)基終止消化，然后與ES細胞一起轉(zhuǎn)入明膠處理過的新板上），可使用6－10天，用前更換培養(yǎng)液（如未用明膠處理培養(yǎng)皿，則需在培養(yǎng)箱中放置2小時以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，這時的Feeder狀態(tài)最好，最適于ES細胞貼壁生長，而且萬一制作的Feeder在第二天早上發(fā)現(xiàn)出了問題，還可以趕緊補做）。

ES細胞培養(yǎng)DMEM+15%FBS

2-巰基乙醇：  5.5uM     1000X     Gibco     21985-023

L-谷氨酰胺：   2mM      100X      Sigma     G8540

LIF： 1000U/mL 10000X   Chemicon   ESGRO? (LIF);   10E7 units，  貨號:ESG1107

非必需氨基酸：100uM    100X      Gibco    11140-050

雙抗： 100X    Gibco      15070-063

ES細胞的復蘇細胞

1.提前制備好相應數(shù)量的Feeder；

2.準備37－39℃的熱水，從液氮罐中取出所需凍存管（凍存細胞），迅速投入熱水中，迅速劇烈搖動直至凍存液全部融化；

3.轉(zhuǎn)入無菌間，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘；

4.棄上清，加入1 ml ES培養(yǎng)液輕輕吹打重懸，轉(zhuǎn)入鋪有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿中（凍存前細胞來自多大的培養(yǎng)皿，復蘇時就用相應大小的培養(yǎng)皿），補加適量培養(yǎng)液；

5.轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液；此后每24小時換一次液，每48小時傳一次代（視生長情況）。

ES細胞的換液

1.提前半小時左右將培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內(nèi)）；

2.細胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，相差顯微鏡下作常規(guī)觀察（判斷生長情況，并確證未發(fā)生污染）后轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)；

3.將ES細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，換新鮮培養(yǎng)基（6 cm培養(yǎng)皿約5 mL，3.5 cm培養(yǎng)皿約3 mL培養(yǎng)基；若死細胞較多則可以先用PBS洗一次，再加培養(yǎng)基）；

4.放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

ES細胞的傳代

1.前一天下午做好所需數(shù)量的Feeder細胞板；

2.提前半小時左右將培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內(nèi)）；

3.將ES細胞培養(yǎng)皿、Feeder細胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出（相差顯微鏡下作常規(guī)觀察，Feeder細胞應生長良好，細胞覆蓋95%左右，至少90%以上的培養(yǎng)皿面積）；ES細胞應生長良好，接近長滿培養(yǎng)皿，細胞集落大小一致、疏密均勻，集落形狀規(guī)則、呈橢圓形、邊緣光滑、表面光滑，細胞生長致密、核大、胞質(zhì)少；

4.將ES細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用約30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，棄去；再作用1?5分鐘，不時觀察，待細胞層（皿底一層白色臟東西樣膜）出現(xiàn)裂縫并明顯開始下滑時，補加培養(yǎng)基，適度吹打（視消化程度及管口粗細而定，至看不到明顯的大的細胞團塊為止）；平均分到Feeder培養(yǎng)皿中（滴加，以免將Feeder細胞吹脫落下來），滴加補加培養(yǎng)基至5 ml左右（滴加，以免將Feeder細胞吹脫落下來；若為3.5cm培養(yǎng)皿，則補加至3ml左右），作好標簽；

5.前后左右水平晃動培養(yǎng)皿，使ES細胞均勻分布于培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。